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如何利用單光子計數(shù)相機輕松搞定FLIM/FRET

更新時間:2023-02-21 點擊量:1361

對于高精度多光子FLIM,時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)在測量精度方面非常優(yōu)秀。就成像速度而言,由于發(fā)射過程的隨機性,要求檢測率遠小于每個激發(fā)事件一個光子,以防止壽命擬合中的不確定性,導(dǎo)致TCSPC在光子計數(shù)率方面受到了極大的限制,于是,激光掃描FLIM的采集時間大約需要幾分鐘才能完成,然而在這個時間尺度上,許多動態(tài)生物事件已經(jīng)發(fā)生并結(jié)束。

為了克服該限制,可以采用激光束陣列激發(fā),并配合光電倍增管陣列或時間門控相機檢測系統(tǒng)來進行并行信號采集實現(xiàn)。迄今為止,由于多陽極PMT中的串擾,亦或是由于相機系統(tǒng)中的測量方法導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差,大大的限制了并行采集大量通道熒光壽命數(shù)據(jù)的準確性。當然,對于單光束掃描系統(tǒng)而言,能通過多陽極PMT中的并行檢測來消除計數(shù)率限制,從而達到增加幀速率的目的,但與此同時,脈沖堆積效應(yīng)導(dǎo)致觀察到的熒光壽命中的計數(shù)率依賴性誤差比較嚴重。此外,各大應(yīng)用中常見的在軸向和橫向都具有較低分辨率的體內(nèi)成像技術(shù),在沒有飽和激發(fā)、顯著光毒性和光漂白的情況下,高NA物鏡是不可能實現(xiàn)。因此,以高時間分辨率定量測量復(fù)雜生物事件的能力仍然是一個重大挑戰(zhàn)。

然而,開發(fā)用于顯微鏡和光譜技術(shù)的SPAD陣列+TDC 單光子計數(shù)相機對于高時間分辨率定量測量復(fù)雜生物事件是至關(guān)重要的。這里使用的32×32 SPAD陣列相機,其中每個像素包含單獨的定時電路。在新型多焦點、多光子FLIM顯微鏡(MM-FLIM)中,通過并行激發(fā)和檢測過程,顯著提高了高分辨率熒光壽命成像的采集速率。該系統(tǒng)的激發(fā)部分為二維超快光束陣列(通過SLM全息生成),該光束共軛并精確對準SPAD陣列+TDC 單光子計數(shù)相機。將收集的熒光小束直接重新成像到SPAD的光敏感區(qū)域上,填充因子光學(xué)放大到100%。每個SPAD在TCSPC模式下運行時,顯微鏡系統(tǒng)有效地由64個單獨的多光子FLIM顯微鏡組成,這些顯微鏡并行工作從而實現(xiàn)高數(shù)據(jù)采集速率。

PF32 SPAD陣列+TDC 單光子計數(shù)相機是武漢東隆科技有限公司中國區(qū)總代理,它是一款32*32面陣SPAD探測器,區(qū)別于一般的SPAD面陣探測器,PF32 SPAD陣列+TDC 單光子計數(shù)相機的1024個單光子敏感SPAD像素陣列,都具有超快的55ps 時間分辨率TDC 電子元件,從而形成了一個并行的,功能強大,高度緊湊的系統(tǒng)。這種并行性讓生命科學(xué)、量子成像、激光雷達抑或是單光子成像領(lǐng)域的科研工作者,更加方便、簡單的獲取和驗證實驗結(jié)果。

參考文獻:

S. Poland et al., “A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging "

Biomedical Optics Express Vol. 6, Issue 2, pp. 277-296 (2015)

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